style="width:3.90674in;height:2.71326in" /> 本文是学习GB-T 34757-2017 猪流行性腹泻 病毒RT-PCR检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR
检测方法的仪器、试剂、样品的采集和处理、RT-PCR 程
序、电泳及结果判定的技术要求。
本标准适用于快速检测猪临床样品(猪小肠和新鲜粪便)或细胞培养物中猪流行性腹泻病毒核酸。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
下列缩略语适用于本文件。
AMV: 鸟类 RNA 病毒反转录酶(avian myeloblastosis virus)
bp:碱基对(base pair)
DEPC: 焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTPs:4 种脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyribonucleoside triphosphates)
PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline buffer)
RNA: 核糖核酸(ribonucleic acid)
RT-PCR: 反转录-聚合酶链式反应(reverse transcriptase-polymerase chain
reaction)
RRI:RNA 酶抑制剂(rnase ribonuclease inhibitor)
Taq 酶：Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)
4.2 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000 r/min 以上。
4.4 冰箱2℃~8℃冰箱和— 70℃以下超低温冰箱。
4.6 微量移液器 量程分别0.2μL～2μL、1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL
和100μL~ 1000μL 的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。
GB/T 34757—2017
5.1 1.5 mL 无 RNA 酶离心管。
除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯。提取病毒 RNA
所用试剂应使用无 RNA 酶的容
器进行分装。
6.1 水 ，GB/T 6682,三级水。
6.2 病毒裂解液：商品化 RNA 提取试剂盒，4℃~8℃保存。
6.6 75%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制， -20℃预冷。
6.7 AMV 逆转录酶及5倍逆转录酶反应缓冲液： 一20℃保存，避免反复冻融。
6.8 DEPC 水：购买商品化 DEPC 水。
6.9 Taq 酶及10倍 Taq 酶反应缓冲液： -20 ℃保存，避免反复冻融。
6.10 RRI:-20℃ 保存，避免反复冻融。
6.11 dNTPs: 含 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各10 mmol/L,-20℃
保存，避免反复冻融。
6.12 DNA 分子量标准：DL2000bp DNA ladder。
6.13 磷酸盐缓冲液(PBS): 配制见 A.1。
6.14 电泳缓冲液(TAE): 配方及配制方法见 A.2。
6.15 样品处理液：配方及配制见 A.3。
6.16 1%琼脂糖凝胶板：配制见 A.4。
6.18 猪流行性腹泻病毒阳性样品及阴性样品：阳性样品的制备参见 C.1,
阴性样品的制备参见 C.2。
阳性样品和阴性样品可由标准编制单位或国家指定实验室提供。
7.1.1 手术刀、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2 h。
7.1.4 组织研磨器或者研钵，经160℃干热灭菌2 h。
宜采集腹泻急性期的小肠(5.0 cm～10.0 cm)或新鲜粪便(5.0 g～10.0
g),放到密封袋中。
将含有样品的密封袋置于带有冰袋的样品运输箱中，送至实验室。样品的运送应在低温保存条件
GB/T 34757—2017
下进行，样品被运到实验室时，所附带的冰袋应没有完全融化。
样品不能被及时送到实验室时，应置于-20℃冰箱中保存，保存期应不超过1个月；如需长期保存
样品，应置于-70℃冰箱。
7.2中采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2℃~8℃下保存应不超过24
h,
-20℃±5℃下应不超过1个月， -70℃以下可长期保存。
取5.0 cm～10.0 cm 小肠组织，用剪刀剪碎，加入5.0 mL～10.0 mL 的 PBS,
用组织研磨器或研钵 研磨后转移到小玻璃瓶中，
一20℃反复冻融3次后摇匀，取1.0 mL 小肠组织液到1.5 mL 离心管中，经
12000 r/min 离心5 min,取500μL 上清备用。
取0.5g～1.0g 新鲜粪便，加入到含5.0 mL～10.0mL 样品处理液(配方见 A.3)
的玻璃瓶中，
-20℃反复冻融3次后摇匀，取1.0 mL 处理过的粪便样品到1.5 mL
离心管中，经12000 r/min 离心
选择市售商品化 RNA 提取试剂盒，按照试剂盒操作说明书提取样品中的RNA。
在提取RNA 时，
应设立阳性和阴性对照样品，按同样的方法提取 RNA。RNA
提取操作应在通风柜或生物安全柜中进
行，避免RNA 气溶胶的污染。
8.2.1 反转录引物序列 下游引物 P2,见附录B。
8.2.2 RT 反应体系 反转录的反应体系参见附录D。
8.2.3 RT 反应程序 42℃水浴1 h,70℃ 灭活15 min, 结束反应。可以直接进行
PCR, 或者放于 -20℃保存备用。试验中设阳性和阴性对照。
8.3.1 PCR 引物序列 见附录B。
8.3.2 PCR 反应体系 参见附录 D。
8.3.3 PCR 反应程序 95℃预变性5 min 后进入PCR 循环，94℃变性30s,52.5℃
退火30 s,72℃ 延 伸30 s,30 个循环，最后72℃终延伸10 min,
结束反应。同时设空白对照。1%琼脂糖电泳分析结果。
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9.1 制备1.0%琼脂糖凝胶板，见附录 A。
9.2 取10.0μLPCR 产物与2.0μL 市售的 DNA
上样缓冲液(6×)混合，加入到琼脂糖凝胶板的加样 孔中，同时加入 DNA
分子量标准作对照。
9.3 盖好电泳仪，插好电极，电压为5 V/cm～10V/cm, 时间为30 min。
9.4 用紫外凝胶成像系统对图片拍照、存档。
9.5 用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。
阳性对照有315 bp 的扩增条带，阴性对照没有相应条带，否则试验不成立。
在阳性对照、阴性对照都成立的前提下，若检测样品有315 bp
的条带，则判定该样品猪流行性腹泻 病毒核酸阳性，否则为阴性(参见图
E.1)。 如需要，可对扩增的条带进行回收，克隆到 T 载体，进行测
序，所得序列与附录 E 中的猪流行性腹泻病毒 M
基因的序列进行同源性比较，以进一步确定样品检测
结果。
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(规范性附录)
溶液的配制
A.1 磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01 mol/L、pH 7.4)的配制
准确称量下面各试剂，加入到800 mL 蒸馏水中溶解，用盐酸调节溶液的 pH
至7.4,加水至1 L。
分装后在121℃灭菌20 min,或过滤除菌，保存于室温。
磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 0.20 g
磷酸氢二钠(Na2HPO₄ · 12H₂O) 2.90 g
氯化钠(NaCl) 8.00 g
氯化钾(KCl) 0.20 g
蒸馏水 加至1000.00 mL
A.2 1× 电泳缓冲液(TAE) 的配制
先配制 TAE(50×) 贮液，使用时再用蒸馏水稀释成1×电泳缓冲液。1 LTAE
的配制(50×):准
确称量242 gTris 碱、57.1mL 的冰乙酸、100 mL0.5 mol/L EDTA(pH
8.0),加入蒸馏水至1 L, 室温
放置备用。
A.3 样品处理液的配制
准确称量下面各试剂，加去离子水定容至200 mL,121℃ 灭菌20 min
后室温放置备用。
氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
乙二胺四乙酸二钠
A.4 1% 琼脂糖凝胶板的制备
准确称取1 g 琼脂糖，加入100 mL1×TAE,
的染料，混匀，倒入制胶板中。
在微波炉中加热，使琼脂糖充分溶解，取出，加入适量
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(规范性附录)
检测猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 方法的引物序列
检测猪流行性腹泻病毒RT-PCR 方法的引物序列见表 B.1。
表 B.1 检测猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 方法的引物序列
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|---|---|---|
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20 pmol/μL |
|
|
20 pmol/μL |
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(资料性附录)
猪流行性腹泻病毒阳性样品和阴性样品
C.1 阳性样品制备
取猪流行性腹泻病毒(PEDV), 用100 mL 的 PBS
稀释至1个病毒半数组织细胞感染量(TCID),
向其中加入不含 PEDV 的猪粪便10 g,摇匀，分装，0.5 mL/ 管，备用。
C.2 阴性样品制备
用PBS 按10:1的比例稀释不含 PEDV 的猪粪便，摇匀，分装，0.5 mL/
管，备用。
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(资料性附录)
检测方法的 RT 和 PCR 反应体系
D.1 RT 反应体系
RNA 20 μL
dNTPs(10 mmol/L) 4.0 μL
RNA 酶抑制剂(RRI) 1.0μL
5×反应缓冲液 8.0μL
AMV 反转录酶 2.0 μL
下游引物 P2(见附录 B) 2.0μL
DEPC 水 3.0 μL
总体积 40.0μL
D.2 PCR 反应体系
反转录产物 3.0 μL
Taq DNA 聚合酶反应缓冲液(10×) 2.5 μL
dNTPs(10 mmol/L) 2.0μL
上游引物 P1 (见附录 B) 1.0μL
下游引物 P2(见附录 B) 1.0 μL
Taq DNA 聚合酶 0.5μL
灭菌去离子水 15.0 μL
总体积 25.0μL
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(资料性附录)
检测样品电泳例图及核苷酸序列
E.1 检测样品中猪流行性腹泻病毒电泳例图
检测样品中猪流行性腹泻病毒电泳例图见图 E.1。
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说明：
M— DNA 分子量标准DL2000;
图 E.1 检测样品中猪流行性腹泻病毒电泳图
E.2 猪流行性腹泻病毒 M
基因第249～563位核苷酸序列(参考CV777 株)
TATGGCCTGCATCACTCTTATGCTGCGGATAATGTATTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGG
CGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAACCCTGAAACTGACGCGCTTCTCACTACTTCTG
TGATGGGCCGACAGGTTTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACT
CCTTAGTGGTACGTTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCA
ATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGT
CGTTCAGTCAA(315 bp)
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